Flow cytometryによるDNA量の解析
- 分裂酵母細胞1mlをエッペンチューブにサンプリングし、8000rpmで 10秒間遠心し、上清をパスツールピペットで静かに除く(なるべく完全に)。次に液を加える前にVortexして細胞をほぐしておくと操作が楽である。(パスツールピペットは取り替える必要はない)
- 沈殿にピペットマンで0.3 mlの滅菌水を加え vortexした後、0.7 mlの95%エタノールを加えvortexしてから氷上に保存する(1時間以上)。この処理により細胞は固定される。
- 酵母細胞を8000 rpm 10秒間の遠心で集菌し、上清をパスツールピペットで静かに除く。
- 沈殿に0.5 mlの50 mMクエン酸ナトリウム液(pH 7.0)を加え、vortexする。遠心で細胞を集菌し、上清を除く。細胞がチューブの底に落ちないで壁につきやすいので吸い込まないように注意する。
- 50g/mlのRNaseAと0.5g/mlのPIを含むクエン酸ナトリウム液を作成し、1mlずつを(4)に加え、vortexし、37℃で1時間保温する(遮光)。
- vortex した後、ファルコンチューブに移す。
- くっついている細胞をソニケーター(設定2で、約10秒間)でバラバラに分散させた後、FACS解析を行うまでアルミホイルで遮光して保存する。
- FACScan (Becton-Dickinson社)により、各サンプルのDNA含量を測定する。
分裂酵母の核のDAPI染色法
- 分裂酵母細胞1 mlをエッペンチューブにサンプリングし、8000 rpmで 10秒間遠心し、上清をパスツールピペットで静かに除く(なるべく完全に)。次に液を加える前にVortexして細胞をほぐしておくと操作が楽である。(パスツールピペットは取り替える必要はない)
- 沈殿にピペットマンで0.3 mlの滅菌水を加え vortexした後、0.7 mlの95%エタノールを加えvortexしてから氷上に保存する(1時間以上)。この処理により細胞は固定される。
- 酵母細胞を8000 rpm 10秒間の遠心で集菌し、上清をパスツールピペットで静かに除く。1 mlのPEMSバッファーを加えvortex で均一にする。
- 再度、遠心で細胞を集め、上清を除く。
- DNAを染色する(DAPI, 最終濃度2g/ml)と細胞壁を染色するCalcofluor(最終濃度1g/ml)を加えたPEMS 100lを加えvortex。ここから遮光する。
- 30℃で30分保温してから10lをスライドグラスにのせる。カバーグラスをかけ、マニキュア液を4辺に塗って固める。蛍光顕微鏡で観察するまで、遮光して氷上におく。蛍光顕微鏡観察は升方研C505室にて1グループずつ行う。
分裂酵母細胞の新生鎖DNA標識法
BrdU labeling of S. pombe cdc25 cells
- pREP41D-ENTKプラスミドをcdc25-22 leu1株に導入。Thiamine (5-10g/ml)存在下でleu+細胞を選択する。resteakでpurify。
- EMM+thiamine培地(5ml)で増殖。
- overnight culture 1 mlをエッペンチューブにとり、遠心(8000rpm, 10sec)で細胞を回収。滅菌水で3回washし(遠心は同条件)、1mlのEMM培地に懸濁する。
- 細胞数を計測し、1.0-1.3x106 cells /mlの濃度にEMM培地にて培養を開始する(25°Cの場合)。
- 20-25°Cに移すと同時にBrdU (10 mM)を終濃度100g/mlに加え、培養する(アルミホイルをまいて遮光する)。
- 1500 rpm 5分の遠心で細胞を回収し、1mlのSP1で2回washする。
- 1mlのSP2+ 4mg/ml zymolyase 20Tを加え、37°Cで30分保温する(25分頃に、1lを取り、9lの0.1% SDSを加えて細胞が壊れることを顕微鏡下で観察する)。
- 2本のエッペンに分け、遠心し、上清を捨てる。
- MagExtractor Protocol #13でDNAを抽出する。
- 遠心、washのあと、乾燥し、20-40lのTE0.1に懸濁。
- 10-20lを制限酵素HindIII or HaeIIIで切断(20-40lの反応液中で)。
- 80000rpm 8-10時間 20℃。
- チューブの上部を切り、先を切ったチップを用いて120lずつ静かにピペットマンで分画する。
- 各チューブに10lの1 mg/ml tRNAを加え、ethanol沈殿。rinse, dry。
- 20lのTE0.1に懸濁。PCR等にて解析。
Electroporation法による大腸菌の形質転換
- (1)Competent Cell の調製
- 大腸菌DH10Bのフレッシュな寒天培養コロニーを数個、5 mlを1LのL-brothに植菌し、37℃で一晩培養する(2本)。
- overnight culture 5 mlを1LのL-brothに希釈し(OD600~0.15)、37℃で振盪培養する(約2.5-3時間)。細胞数を顕微鏡で計測する。
- OD600=0.5程度(1 x 108 cells/ml)になったら、氷水中で冷やし、4000 xgで15 min 4℃で集菌する。
- 1Lの氷冷した10% Glycerolに懸濁し、再遠心する(同条件)。上清を捨てる時、注意しないと細胞が流れる。
- 500 mlの10% Glycerolに懸濁し、再遠心する(同条件)。
- 20 mlの10% Glycerolに懸濁し、再遠心する(同条件)。
- 1 x 1011 cells/mlになるように氷冷した10% Glycerolに懸濁する。
- 細胞液 を40lずつエッペンチューブに分注し(100lも作ると良い)、dryice-EtOH中で凍らせて、-80℃で保存する。
(2)Electroporation
- 細胞を室温で溶かし、氷中にたてる。
- DNA (1pg~10 ng)を加え、vortex する。
- 0.2 cm幅のキュベットにいれ、Gene Pulserで200 ・ 25F 2500 Vの設定でパルスをかける。
- すぐに1 mlのL-brothを加え、試験管に移し37℃で1時間振盪する。
- 100-500lをプレートにまく。(目標効率は1 x 109/g DNA)37℃で培養。
(注意)
- 使用したキュベットは、流水15回、脱イオン水3回、ミリQ水3回の洗浄後、アルコールに漬けておく。
- 10% GlycerolはミリQ水を使用。
- キュベットに細胞を入れたあと、手で振って遠心力で細胞をキュベットのそこに落とすこと。(さもないと火花が散ります。)
- キュッベットの外側をキムワイプでよくふいてからパルスをかけること。
(さもないと火花が散ります。)
Electroporationによる分裂酵母形質転換法
- 分裂酵母細胞をYE培地(或いは他の培地)中で1 x 107 cells/mlにまで増殖させる。(50 ml for 10 samples)
- 2000 rpm 5 min 4℃の遠心で集菌する。
- 氷冷した1.2 Mソルビトールに懸濁し、再遠心する。3回繰り返す。( x1, x0.5, x0.2 volumes) 注:x1の時は2500 rpm
- 1 x 109 cells/mlになるように、氷冷した1.2 Mソルビトールに懸濁する。(0.5 ml for 10 samples) キャリアーDNA(1 mg/ml、sonicated salmon testis DNA: Sigma)を10g加える。
- 細胞液 を50lずつエッペンチューブに分注し、sample DNA (0.1-0.2g)を加えvortexし、氷冷したキュベット(0.2 cm)に移す。5-7は1本ずつ連続操作。
- Gene Pulserで200W 25F 2000 Vの設定でパルスをかける。
- すぐに氷冷した1.2 Mソルビトール0.45 mlを加える。
- 50-100lを選択培地プレートにまく。(効率は1 x 104-5/g DNAです。)
プラスミドDNA調製法
- プラスミドをもつ大腸菌のovernight culture 1-2 mlを100 mlのL-amp培地に加え、37℃で1晩、培養する。
- Tomi TA-300Cローターにより、6,000 rpm、7分間の遠心で集菌する。
- 上清を捨て、5 mlの50 mM Tris-HCl (pH 8.0)-10% sucrose液に懸濁する。
- Beckman polycarbonate tube (30 ml用)に移し、0.5 mlの10 mg/mlリゾチーム溶液 を加え、ピペットで静かに混ぜ、室温で5分間静置する。
- 0.5 mlの0.5 M EDTA(pH 7.5-8.0)を加え、静かに混ぜる。室温で約10分間静置し、粘度の上昇をみる。
- 5 mlのLysing solution (20 mM EDTA, 1% Triton X-100)を加え、直ちにBeckman Type 50.2Tiローターで、24,000 rpm 30min 4℃ (10℃でもよい)の遠心を行う。
- 上清(約10 ml)を冷却遠心機用遠心管に取り、5 mlの30%ポリエチレングリコール (PEG6000 or 8000)-1.5 M NaCl溶液を加え、パラフィルムをして、反転撹拌する。氷中で1時間以上置く。
- トミー冷却遠心機でTA-24BHローターで8000 rpm 15 min 4℃で遠心する。
- 上清を捨て、しばらく逆さにして水分を除く。キムワイプで沈殿に触れないように水分をふき取る。
- 沈殿に1.5 ml(正確に)の10 mM Tris-HCl(pH 7.4)-10 mM EDTAを加えパスツールピペットで懸濁し、1.70-1.75g(正確に)の塩化セシウムと120lの10 mg/mlのエチジウムブロマイド(Ethydium bromide) を加え、混合する。
- 2本のエッペンチューブに分注し、15,000 rpmで2分間遠心する。
- 1上層の膜状のゴミをとらないようにして、パスツールピペットでDNA溶液Quick- seal tubeにつめ、キムワイプで口付近(内側)をきれいにし、熱でシールする。
- RP120VTローターで、120,000 rpm 2.5時間、20℃の遠心を行う。
- UVランプでプラスミドDNAの位置を確認し、遠心管の底にピンで穴を開け、次に 遠心管の上部に穴を開け、上部の穴を指で調節しながら、底の穴から液を滴下させる。 プラスミド分画は約0.3 mlとして回収できる。
- あらかじめ調製しておいた、塩化セシウム液(100 g Secium chloride, 100 ml H2O-10 mM EDTA-5g/ml Ethydium bromide) にプラスミド分画を加えて、再遠心する。
- 再びプラスミド分画を回収し、透析チューブにつめて0.5-1Lの10 mM Tris-HCl (pH 7.4)-1 mM EDTAに対して、3時間透析する。
- DNA溶液をエッペンチューブに移し、等量の水飽和フェノールを加え、数回反転撹拌する。
- 12,000 rpm 2 min、室温の遠心で、フェノール層と水層を分離し、水層を新しいチューブに移し、フェノール抽出を繰り返す。
- 水層をとり、約2倍量のクロロフォルムで抽出する。2回行う。
- 水層をエッペンチューブにとり、2.5倍量の酢酸ナトリウム・エタノール液 (0.1 N 酢酸ナトリウム pH 7.0-97% ethanol)を加え、-20℃、30分置く。
- 15,000 rpm 10 min 遠心し、上清を捨て、80%エタノールで2回リンスする。
- 真空遠心機内で乾燥した後、適量のTE0.1(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA)を加え、30分ほど静置してから、懸濁する。
- DNAの一部(2.5l)をとり、500lの水に希釈して、吸光度A260を測定する。
- Double strand DNA 1g/ml = 0.02 OD260
- DNA濃度を1 mg/mlにあわせ、冷凍保存する。
Sequencing反応
Sample preparation for ABI DNA sequencer
- Add 1l of 10 mg/ml Rnase A to mini-prep DNA solution and incubate at 37°C for 30 min.
- Phenol/Chloroform extraction and EtOH precipitation
- Suspend DNA in 20-40l of TE or 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and check DNA concentration by loading 1l of DNA onto agarose gel electrophoresis.
- Alternatively, purify DNA through CsCl centrigugation (see CsCl protocol)
- Mix the following reagents in a PCR tube.
Ready Reaction Mix |
2ul |
5x Sequencing buffer |
1ul |
Template DNA |
(300-500 ng) |
Primer (3.2uM) |
1ul (3.2 pmol) |
MiliQ water |
X |
Total |
10ul |
- PCR reaction; 96°C/10 sec > 50C/5 sec > 60°C/4 min, 25 cycles
- Add 10l miliQ water and transfer into 0.5 ml tube.
- Add 50l EtOH containing 0.1 M NaAc, stand at room temp for 15 min.
- Centrifuge at 15,000 rpm for 20 min, remove sup.
- Rinse with 70 % ethanol (0.5 ml), dry
- Add 15l of sample buffer.
- Incubate at 95C for 2 min,
- Transfer the solution into Sequencer tube and set into the machine.
Computer operation
- Open ABI Collection file.
- File > New > Sequence Sample Sheet 48 tubes.
- Input sample information.
- File > New > Inject List.
- Choose your sample sheet.
- Run.
Finishing operation
- Keep the gray cap of the tube and re-use at the next time.
After the electrophoresis, set the laser power “0” unless you or another person will use the machine in a couple of days. (Very important !!)
Western blotting
- Transfer proteins to PVDF membrane with semi-dry conditions.
- Wash membrane for 10 min in TBST buffer.
- Incubate the membrane for 30 min in blocking buffer.
- React with 1st antibody in 0.5 x blocking buffer for 1 hr at 37°C.Mcm6 antiserum was used at a 1/1-2,000 dilution.
- Wash membrane in TBST buffer for 10 min x 3 times.
- React with the 2nd antiboby (AP-conjugated anti-rabbit IgG: Promega) at a 1/5,000 dilution in 0.5 x blocking buffer at 37°C for 30 min.
- Rinse the membrane for 10 min x 3 times.
- Visualize with Staining solution (Promega).
TBST buffer
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
150 mM NaCl
0.05% Tween 20
Blocking buffer
TBST with 1% Skimmilk and 2% BSA
分裂酵母培地作成、大腸菌培地作成
YE (Ade, Ura, Leu) プレートの作成
- 脱イオン水を1Lメスシリンダーではかり、ロー瓶にいれる。
- Adenine 75 mg
Uracil 75 mg
Leucine 75 mg
を精密天秤ではかり加える。
- 2. Bact Yeast extract 5 g
Glucose 30 g
Bact Agar 20 g
をはかり、加えて、パラフィルムをして攪拌しとかす。
- オートクレーブ、120℃、20分で滅菌する。
- オートクレーブが終了したら、寒天を均一にし、適温までさましてから、約20 ml相当ずつ、シャーレーにいれて固まるのを待つ。
- 安全ベンチ内でシャーレーの蓋を取り、逆さにして30分乾燥させてから、袋に入れて保管する。
★液体培地の場合にはAgarを入れない。
★YE plateはAde, Ura, Leuを加えない。
Lプレート、L-Ampプレート作成
- 脱イオン水を1Lメスシリンダーではかり、ロー瓶にいれる。
- NaCl 5g
Bact Yeast Extract 5g
Bact Tryptone 10g
を加え、パラフィルムをして完全に溶かす。10 MのNaOHを約0.3ml加え、
pH試験紙でpH 7.0-7.5の範囲にあることを確認する。
- 寒天15gを加える。
- オートクレーブ 120℃、20分滅菌、終了したら、寒天を均一にする。
- 適温までさめてから、Ampicillin + Methicillin (いずれも10mg/mlストック)を最終濃度30g/mlになるように加え、均一にし(気泡が入らないように)、シャーレーにまく。
- 固まってから、20分乾燥し、冷暗所に保管する。
★Ampicillin, Methicillinを加えないものをLプレートとする。