プロトコール No.4
「SDS-PAGE」 （ver.1）

【SDS-PAGE用ゲルの作製】

1.　ガラスの組み立て
        ガラス、ゴム、コームをエタノールで拭く。
        ガラスを組み立てる。
            ＊注：ゴム下部が平らになるようにする。一枚のガラスに使用するクリップは
　　　　　　　同じ種類のものにする（圧を一定にするため）。

2.　コームを入れて、コーム下1 cmの所にマジックで印を付ける。
        印のところまでセパレーションゲルを入れる。

3.　セパレーションゲルの作製
        ゲルの%の表に従い、以下のようにゲル溶液を作る。
        小ビーカーまたは50 ml遠心管に下記の順に液を入れる。
                30 % アクリルアミド溶液（4 ℃、遮光）
                DW水（distilled Water：蒸留水, deionized Water：脱イオン水）
                セパレーションバッファー Tris HCl（pH 8.8）、0.4% SDS（sodium dodecyl
　　　　　 sulfate：ドデシル硫酸ナトリウム）（4℃）
        ここまで入れたら、よく混ぜ、室温に置く。使用した元の溶液は4℃に戻しておく。
        15% APS（ammonium persulfate：過硫酸アンモニウム）（−30 ℃保存）を
　　　on iceで溶かしておく。
                15% APS（−30 ℃）
                TEMED（N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン）（4 ℃）
        静かにすばやく混ぜる（泡立てない）。
        ガラスの印まで液を注ぎいれる
        DW水または、水飽和ブタノールをピペットで静かに注ぎ入れ、液面を平らにする。
        15% APS（−30 ℃）（on ice）、TEMED（4 ℃）をそれぞれ戻す。
        固まるまで待つ（1 hr位）。
        ゲル上部の水をペーパータオルで吸い取る。
        ブタノールの場合は、DW水でよく洗ってからペーパーで水気を取る。
            ＊注：ゲル表面を触らないよう、注意深く行う。

4.　スタッキング（濃縮ゲル）の作製
        小ビーカーまたは50 ml遠心管に下記の順に液を入れる。
                3% アクリルアミド、SDS溶液（スタッキング用）（4 ℃、遮光）
                15% APS（−30 ℃）
                TEMED（4 ℃）
        ここまで入れたら、静かにすばやく混ぜる（泡立てない）
        ガラス凹部上部まで、液を注ぎ入れる。
        コームを静かに差し込む。あふれてもよい（ペーパータオルを敷いておく）。
            ＊注：気泡がコームの先に残らないようにする。
        固まるまで待つ。
        ゲルを保存する。
            ＊注：ゴムを先にはずしてからクリップをはずし、湿らせたキムワイプをガラスの
　　　　　　　上に載せ、ラップをかける。
        ゲルの%、作製日、（作製者名）を記入し、4℃で保存する。


【SDS-PAGE用プロテインマーカーの作製】

1.　ミニエッペンチューブに（×1）Dyeを以下のように作る。
            （×5）Dye           40μl
                マーカー試料     10μl
            　    ＋DW水        150μl　　／計200μlにする。

2.　95 ℃、5 min、boilし、−30 ℃保存しておく。


【固定液の準備】

　固定液（20 % メタノール、7.5 % 酢酸溶液）を以下のように作る。
                メタノール 　200 ml
                酢酸　　　　　75 ml
　                ＋DW 水　／計1リットルにする。


【泳動槽の準備】

1.　ゲルを準備する

2.　泳動槽を組み立てる
　　　オレンジ色ゴムパッキンのついた泳動槽に、SDS-PAGE用ガラスを、凹んだ方を内側
　　　にして透明アクリル棒でセットする（コームは差したまま）
            ＊注：泳動するゲルが一枚だけのときは、反対側にガラス一組を、バッファーが
　　　　　　　漏れないように逆さまに（凹んだほうを外側にして）取り付ける。

3.　泳動槽にバッファーを入れ、気泡を除く
　　　外側の槽にバッファーを3 cm位入れる。
　　　ガラスをセットした泳動槽を入れる。
　　　曲がった先端を付けたシリンジにバッファーを吸い込み、押し出す勢いで、ゲル下部の
　　　空気を除く。
　　　内側にバッファーを入れる。（ガラスの凹部の十分上まで）
　　　コームを静かに引き抜く。


【サンプルアプライと泳動】

1.　25 μlガラスシリンジで各ウェル（レーン）にサンプルをアプライする。
        マーカー　4〜5 μl
        サンプル　5 μl（4〜10 μl）

2.　シリンジをウェル下部まで入れ、静かに注ぎながらシリンジを引き上げる。
        18レーン＋両端の太いレーン
        アプライしたら速やかに電流を流す。
                CC（constant current：電流一定）で
                ゲル1枚あたり：　15 ｍA、約90 min
　　　　　　　　　                25 ｍA、約60 min
                ゲル2枚なら電流を2倍にする。

3.　青いdyeのラインがゲル下部5 mm位まできたらストップ。電流を0にして電源をOFF。


【クイックCBB染色】

1. 　固定
　　　固定液をタッパーに入れる。（回収固定液でよい）
　　　バッファーを捨てて、泳動槽を解体する。
　　　ゲルのガラスをスパーテルなどで静かに開く。
　　　スタッキングゲルとセパレーションゲルをスパーテルで切り離し、セパレーションゲル
　　　を固定液のタッパーに入れる。
　　　スタッキングゲルは紙に包んで捨てる。
　　　5 minシェーカー。dyeが青から緑になったらOK
　　　固定液は回収ボトルに戻す。　

2.　染色
　　　クイックCBB染色液（回収液でよい）をゲルがかぶるくらいタッパーに入れ、ラップする。
　　　電子レンジで1〜2 min暖める。（強く沸騰するとゲルが割れる）
　　　15〜30 minシェーカー。
　　　染色液は回収ボトルに戻す

3.　脱色
　　　DW水で染色液を洗い流し、十分量のDW 水を入れてラップする。
　　　電子レンジで1〜2 min暖める。（強く沸騰しないように）
　　　キムワイプ2〜3 枚入れてシェーカー1〜2 hr。
　　　キムワイプを替えて、これを繰り返す。
　　　またはオーバーナイトでシェーカー。


【SDS-PAGEの写真撮影とファイル保存】

1.　ゲルとフロッピーディスクを用意。

2.　各スイッチON。（本体下部、上部）
        コンピューター、 モニター、プリンター
        パネルをセット、スイッチON

3.　パネルにラップを敷いてゲルを載せる。

4.　絞り、倍率、ピントを合わせる
        freezeを押すと画面が静止する。
        Printを押すと写真を一枚プリントアウトする。
        Recordを押すとフロッピーディスクに書きこむ。
            ＊注：フロッピーディスクには画像が4 枚しか入らない。それ以上入れると上書き
　　　　　　　されて前の画像データが消えるので注意。画像データをパソコンのハード
　　　　　　　ディスクにコピーし、フロッピーディスクはファイルを消しておく。

5.　各スイッチOFF
        ゲルをラップでくるみ、サンプル名、日付を書いておく。不要になったら捨てる。
        パネルなどを片付ける。
        写真にサンプル名、日付を書いて保存。
        各レーンのサンプルは熱処理をしたものか、遠心して沈殿したか上清だったかを記録する
　　（プロトコール No.3 参照）
                未処理の上清　　LS
                未処理の沈殿　　LP
                熱処理の上清　　HS
                熱処理の沈殿　　HP



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