プロトコール No.1
「ミニプレップ」（ver.1）
１日目（トランスフォーメーション）
【プレート作製】
1. LBL （Luria-Bertani-Lennox）プレートを作製する。
Agar （培地用寒天）1.5%
LBL pH 7.2−7.4 1リットル
＊LBL培地（×1、1リットル）：
酵母エキス 5 g
ポリペプトン 10 g
NaCl 5 g
H2O
+NaOH (final pH 7.2 - 7.4)
2. オートクレーブする（120℃、20 min）
＊注：密栓できるキャップ付き容器の場合は、爆発を避けるために、ふたを少し
ゆるめてオートクレーブする。
3. 熱いうちに、空気が入らないように静かにまぜて、Agarをよく溶かす。
＊注：このときも、爆発を避けるために、密栓をせず、少しキャップをゆるめる。
4. 抗生物質を入れるときはオートクレーブ後、少し（50℃位）冷めてから入れる。
(+)Amp プレート：(+) 50 mg/ml Amp 1 ml ／ LBL 1リットル
(+)Amp (+)Cm プレート：(+) 50 mg/ml Amp 1 ml ＋ (+)Cm 2 ml／LBL
1リットル
(+)Cm プレート：(+) 20 mg/ml Cm 1 ml ／ LBL 1リットル
＊(+)Amp ＝ アンピシリン
(+)Cm ＝ クロラムフェニコール
＊ 注：冷ましすぎると、Ampが混ざらない。
5. 少し冷ました培地を新品プレートに分注していく。
6. プレートの半分くらいまで（約25 ml）入れる。
7. 冷えて固まったら、作製日、抗生物質の有無、作製者名をテープに記入して、4℃で
ストックする。
8. 抗生物質を後から塗布する場合
1プレート（約25 ml）あたり、（×1000）抗生物質25 μl塗布する。
滅菌Milli-Qで倍に希釈したものを50 μl塗布してもよい。
（均一に塗布できる。）
【トランスフォーメーション】
1. プレートを8枚用意する。
LBL＋Amp（アンピシリン）アガロース1.5 % プレート。
37℃恒温機でふたをとり、下向きにして水滴を乾燥させておく。
＊注：作った直後は、寒天の表面に少し“しわ”ができる程度に10〜20 min程度、
乾燥させる。
2. プラスミドpET-11a（−30℃ Freezer）を常温で溶かす。
＊pET-11a については以下のURLを参照：
http://www.novagen.com/Products/ProductDetail_NVG.asp?catNO=69436
3. 恒温槽を42℃に暖めておく。
4. Rosetta-gamiTM(DE3)のコンピテントセル100 μl（−80℃ Deep Freezer）を
on iceで少し溶かす。
＊注：コンピテントセルは熱に弱いので、作業はすべてon ice で行う。
5. 丸小シールにプラスミドの番号を書き、コンピテントセルのエッペンチューブに貼る。
6. プラスミド1〜2 μlをコンピテントセルに加える。
＊注：1〜2回ピペッティングし、ピペットの先でゆっくり手早くまぜる。
7. on ice、20 min
この間に乾燥させたプレートにプラスミド番号、大腸菌の種類、日付を書く。
8. heat shock：42℃、90 sec
9. on ice、1 min以上。（37℃に戻ればよい）
10. 温めておいたプレート（LBL＋Ampアガロース1.5 % プレート）に無菌状態で塗布する。
11. 37℃恒温機に入れてオーバーナイト。
12. Rosetta-gamiTM (DE3) は16〜24 hrでコロニーが生えてくる。適度な大きさになった
ら、逆さまにして4℃で保存、1ヶ月ぐらいまでは使える。
２日目（無菌操作、培養）
1. ふた付き6連チューブ（オートクレーブ済み）に液体培地LBL＋Ampを3 mlずつ入れる。
2. コロニーを爪楊枝でつついて培地に植菌する。
ホイルのかかった滅菌済み爪楊枝を、バーナーであぶって滅菌したピンセットで取り出し、
使用済みのビーカーに入れる。
使用済み爪楊枝はホイルをかけ、24 hr以上乾熱滅菌する。
3. ミニプレップ用37℃恒温機で振とうする。オーバーナイト24 hr以上。
３日目（ミニプレップ）
1. カルチャーしたサンプル用チューブとふたなし6連チューブ（オートクレーブ済み）を
ミニプレップマシンへ。
2. ミニプレップマシン
試薬のチェック
廃液のチェック
Power On
Start
チューブをセットする。手前から1番とし、セットした順番をメモする。
右 保存用（空のチューブ）
左 サンプル用（ふたを取ってセット）
AUTOMATIC RUN _ ENT
TOTAL SAMPLE _ 48 _ ENT
FILE No. _ 2 _ ENT
System Check
Reagent
Start（システムチェックのスタート）
Start（マシンのスタート）
4 hr位で終了。オーバーナイトでかけてもよい。
４日目（アガロースゲル電気泳動）
【サンプルの回収】
1. ミニプレップ終了後の保存用チューブにTE（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA）を
50 μlずつ分注し、ボルテックスミキサーで攪拌する。
＊Tris：tris-(hydroxymethyl) aminomethane（2-amino-2-hydroxymethylpropane-1,3-diol）
EDTA：Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid
2. ミニエッペンチューブにプラスミドの種類、番号（例：pET11a_0312）、および
シリアル番号を記入し、保存用チューブから、各エッペンに移す。
＊注：回収しにくいが、なるべく全量とるようにすること。
【サンプルの電気泳動】
1. RNase（リボヌクレアーゼ）＋DNA dye（色素）（−30℃ Freezer）をDNAプレート
のウェルに1 μlずつ分注する。
＊DNA dye：
BTB（bromo thymol blue） 2.5 mg
グリセロール 5.0 ml
0.5 M EDTA 0.2 ml
＋ H2O ／計10 mlにする。
2. ミニエッペンの各サンプル2 μlをそれぞれのウェルに入れ、2〜3回ピペッティングする。
3. ふたに湿らせたキムワイプを載せ、パラフィルムで密閉してからDNAプレートを上下
裏返して37 ℃インキュベート。（1hr or オーバーナイト）
4. 泳動待ちの間、ミニエッペンの各サンプルは、一旦、−30℃ Freezerにストックしておく。
5. 0.7% アガロースゲル（TAKARAのAgar）/TBE (Tris-borate EDTA) ＋ EtBr
(ethidium bromide) をミューピットのゲル作製用で作る（1つのゲルに対してコームを
上下2段で作製する）。
泳動用バッファーTBE＋EtBr：（×10）TBEから（×1） TBEを作製。
（×1）TBE 1リットルにEtBr 10〜20 μl入れる。
＊注：泳動用バッファーにEtBrを入れていないと下のバンドは出にくい。EtBrは冷蔵庫
に保存。発がん性があり危険なので、必ず手袋をして扱うこと。
6. DNAプレートのサンプルを全量（3 μl）とDNAマーカー1〜数μl（−30℃、Freezer）
をウェルに加える。
＊使用したDNAマーカー：
λファージ 44 μl
（×10）Mバッファー 5 μl
Hind III 1 μl ／計50 μlにする。
37℃、オーバーナイト
DNA dye を等量50 μl加え、合計100μlにする。
−30℃で保存する。
＊使用した（×10）Mバッファー（Universal Buffer）：
100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
100 mM MgCl2
10 mM ジチオスレイトール（dithiothreitol）
500 mM NaCl
7. 泳動。100 ｍV、20 min 〜 200 ｍV、10 min
【泳動したゲルの写真撮影】
1. 撮影装置の設定
Printgraph、Fluo-LINK ON （押す）
モニター ON
ATTA Image Saver ON
SEIKOSHA VP 1500II ON
2. 透明アクリル板の上に100% EtOHを少量載せ、その上にラップを貼る。
3. ラップの上に泳動したゲルを載せ、絞り、ピント、倍率を合わせて写真を1枚撮る
（printを押す）。
4. バンドが確認できない、バンドの泳動がおかしい場合は、その番号のミニエッペン
チューブを捨てる。
5. 写真にサンプル名、No、どの番号を捨てたか、などを記入し、ノートに貼る。
6. プラスミドが足りなくなったら、再度カルチャー→ミニプレップマシン→チェック
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