プロトコール No.2
「大腸菌のグリセロールストックおよび
コンピテントセルの作製」
（ver.1）
【培養】
1. ゴムのふたのついたコルベンビンを乾熱滅菌する（胞子も含めた滅菌は、通常180℃
15 hrだが、われわれの研究室では約120℃、24hr以上）。
2. エッペンチューブに990 μlのGTE（glucose/Tris/EDTA）溶液と、−80℃のグリ
セロールストックの大腸菌を約10 μl入れる。LBLプレート（プロトコール
No.1
参照）
（E. coli DH5αおよび BL21(DE3) の場合は、Amp(-)、Cm(-)とし、Rosetta-gamiTM
(DE3) の場合は、Amp(-)、Cm(+)とする）に、塗布する。
＊GTE溶液：
1 M Tris HCl（pH 7.6） 2.5 ml
0.5 M EDTA（pH 8.0） 2.0 ml
20% グルコース 4.5 ml
＋H2O ／計100 mlにする。
3. 37℃で一晩インキュベートする．
4. 乾熱滅菌済みのキャップ付き試験管に、LBL液体培地（DH5αおよびBL21(DE3)の
場合は、 Amp(-)、Cm(-)、Rosetta-gamiTM(DE3)の場合は、Amp(-)、Cm(+) ）
を3〜5 ml 分注する．
5. 発現してきたコロニーを1つ、乾熱滅菌済みの爪楊枝で液体培地に植菌し、37℃で
振とう培養する．
6. 菌数を「トーマ血球計算盤」で１マスで平均5匹（1×10８/ml）になっているかを
顕微鏡で確認する．菌数が満たないときは、再度培養する。
＊注：トーマ血球計算盤はスライドガラスにカバーガラスを載せて、そのすきまに
10 μlの培養液を静かに入れる。使い終わったら、Milli-Q水で洗う。）
7. 培養液を1 ml 採り、LBL液体培地100 mlが入ったコルベンビン（4.のLBL液体培地と
同じ）に入れ、37℃で振とう培養する（前もってコルベンビンのLBL液体培地を37℃
にしておくと温度差がなくてよい）。
＊注：1×108/mlになる目安は以下の通り。
Rosetta-gamiTM(DE3)：試験管前培養 約4時間、コルベン振とう 約4時間
BL21(DE3)、DH5α：試験管前培養 2〜3時間、コルベン振とう 2〜3時間
【グリセロールストックの作製】
1. 大腸菌をLBL培地で培養する。
2. 菌数が1×108/mlになったのを確認して、グリセロールを最終濃度15%になるように
加える。
3. 0.8 mlエッペンに菌液を100 μlずつ分注する。
4. エッペンを液体窒素に漬けて凍結させ、−80℃ Deep Freezerで保存する。
【コンピテントセルの作製】
1. 大腸菌をLBL培地100 mlで培養する。このときCaCl2溶液を氷で冷やしておく。
2. 菌数が1×108/mlになったのを確認して、50 mlファルコンチューブで50 mlずつ
遠心して集菌する。 5000 rpm 、5 min 、4℃
3. 沈殿を崩さないように上澄みを捨て、それぞれ20 ml（培地の2/5量）の 50 mM
CaCl2（冷）を加え、 沈殿を静かに懸濁する。
＊注：以下、すべてのCaCl2 溶液は氷で十分に冷やしておいたものを使用する。
4. 遠心して集菌する。5000 rpm、5 min、4℃
5. 沈殿を崩さないように上澄みを捨て、それぞれ5 ml（培地の1/10量）の50 mM
CaCl2（冷）を加え、沈殿を静かに懸濁する。
6. 遠心して集菌する。5000 rpm、5 min、4℃
7. 沈殿を崩さないように上澄みを捨て、それぞれ2.5 ml（培地の1/20量）の50 mM
CaCl2＋15%グリセロール（冷）を加える。ピペットマンで対流を起こし、沈殿を
静かに懸濁する。
＊注：ここから9. までに、15 min以上氷上に置いておく必要があるが、時間が
かかると菌が死ぬので手早く行うこと。
8. あらかじめ氷で冷やしておいた0.8 mlエッペンに菌液を100 μlずつ分注する。
＊注：カルシウム処理菌は死にやすいので氷上を守ること。
9. エッペンを液体窒素につけ凍結させ、−80℃のDeep Freezerで保存する。
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