プロトコールNo.5
「SeMet化タンパク質の量産化」（ver.1）
１日目
・夕方
BL21(DE3)のメチオニン要求株であるB834(DE3) を発現プラスミドで形質転換する。
LeMaster 培地のうち、autoclavable portion を準備する。
Wako Core 培地 23.6 g をはかり、１リットルの水に溶かし、オートクレーブする。
ラクトース 10 g をはかり、100 ml の水に溶かし、オートクレーブする。
２日目
・朝（９時頃）
5 ml の LB 培地に、コロニーを数個植菌する。
１リットルあたり２本（5 ml×2 = 10 ml、本培養体積の 1%）
・LeMaster 培地を完成させる
１リットルの core 培地（オートクレーブ済み）に以下のものを加える。
1) ラクトース 10 g（オートクレーブ済み）
2) SeMet 50 mg、MgSO4・7H2O 250 mg、FeSO4・7H2O
4.2 mg
（15 ml の水に溶解し、0.22 μm のフィルタで滅菌）
3) ビタミン液（SIGMA KAO and MICHAYLUK VITAMIN SOLUTION）10 ml
4) 抗生物質 Amp（final 50 μg/ml）
すべて添加した後、37℃のシェーカーに入れ、pre-incubation する（〜２時間）。
・昼（12時頃、前培養を始めてから約３時間後）
１リットルの LeMaster 培地（37℃で pre-incubation 済）に前培養 5ml×2本（菌数が1×108
cells/ml）を植菌する。
３日目
・10時〜13時頃
集菌する。
ポイント
・pre-incubation したほうが増殖がよい
・前培養から本培養への植菌のタイミング（菌数）が重要！
【１０リットル用の SeMet core 培地の組成】
［アミノ酸、塩基］
L-alanine 5.0 g
L -arginineHCl 5.8 g
L-aspartic acid 4.0 g
L-cystine 0.3 g
L -glutamic acid 6.7 g
L -glutamine 3.3 g
glycine 5.4 g
L -histidine 0.6 g
L -isoleucine 2.3 g
L -leucine 2.3 g
L -lysineHCl 4.2 g
L -phenylalanine 1.3 g
L -proline 1.0 g
L -serine 20.8 g
L -threonine 2.3 g
L -tyrosine 1.7 g
L -valine 2.3 g
L -adenine 5.0 g
guanosine 6.7 g
thymine 1.7 g
uracil 5.0 g
［その他］
sodium acetate 15.0 g
sodium succinite 20.6 g
ammonium Cl 7.5 g
K2HPO4 105.0 g
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合計 235.8 g
１０リットルの SeMet 化培地を完成させるには、さらに以下の試薬を別々に加える必要あり。
・DL-seleno-methionine 500 mg （← L-seleno-methionine なら 250 mg）
・lactose 100 g （← glucose なら、IPTG で誘導をかける必要あり）
・MgSO4・7H2O 2.5 g
・FeSO4・7H2O 41.8 mg
・H2SO4 (conc.) 83 m ← なくてもよい